Simultaner Nachweis von Chlamydiaceae, Coxiella burnetii und Neospora caninum mittels Real-Time Multiplex-PCR
Wolfgang Gaede und Abdelfattah Monged Selim
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin Stendal
Vertreter der Familie Chlamydiaceae sowie Coxiella burnetii und Neospora caninum zählen in Deutschland zu den häufigsten infektiösen Ursachen von Aborten und anderen Reproduktionsstörungen bei Wiederkäuern. Für den sensitiven direkten Erregernachweis im Rahmen der Abortdiagnostik hat sich die PCR etabliert.
Der simultane Nachweis dieser Erreger ist mittels Real-Time Multiplex-PCR unter Zusammenfassung gut dokumentierter Literaturprotokolle validiert worden. Im Einzelnen wurden ausgewählt:
- Chlamydiaceae: FLI- Protokoll, s. auch Ehricht et al. (2006)
- Coxiella burnetii: Klee et al. (2006):
- Neospora caninum: Großmann, pers. Mitteilung 2005, s. auch Sörgel et al. (2009)
Als Extraktionskontrolle wurde der ß-Actin-Nachweis (Toussaint et al., 2007) integriert. Alle PCR-Reaktionen wurden mit dem Quantitect Multiplex-PCR Kit (no ROX) von Qiagen durchgeführt.
Für die Ermittlung der analytischen Sensitivität wurden zunächst von der Firma GeneExpress in Auftragssynthese hergestellte Plasmide titriert. Damit wurden reproduzierbare Nachweisgrenzen von 0,13 Kopien je PCR-Reaktion bzw. 33,3 Kopien pro ml Template ermittelt. In weiteren Versuchen wurden geringe Kopienzahlen eines Erregers auch bei hohem Überschuss der anderen Erreger mit unverminderter Sensitivität detektiert. Falsch-negative Ergebnisse infolge kompetitiven Quenchings sind daher nicht zu erwarten.
Anhand der Titration von schwach-positiven Feldproben wurde die gleichwertige Sensitivität der Real-Time Multiplex-PCR im Vergleich zu den bisherigen im eigenen Labor verwendeten Prüfverfahren festgestellt [Chlamydien: real-time PCR lt. FLI-Protokoll, s. auch Ehricht et al. (2006); Coxiella burnetii: konventionelle PCR nach Edingloh et al. (1999); Neospora caninum: semi-nested PCR nach Baszler et al. (1999)].
Die Inklusivität der verschiedenen Spezies, Subtypen etc. wurde im Wesentlichen als durch die Publikationen gesichert angesehen.
Bei der exemplarischen Prüfung der analytischen Spezifität (Exklusivität) wurden gegen tierartspezifische Matrizes sowie wesentliche differentialdiagnostisch relevante Erreger keine Kreuzreaktionen festgestellt.
Für die Überprüfung der diagnostischen Sensitivität wurden positive Feldproben re-analysiert. Für Chlamydien lagen in 93 Fällen übereinstimmend positive Ergebnisse zur Real-Time PCR lt. FLI-Protokoll vor. Der mittlere Ct-wert lag bei der Real-Time Multiplex-PCR bei 31,2; beim FLI-Protokoll bei 31,5. Drei zuvor positive Proben blieben in der Real-Time Multiplex-PCR negativ. Andererseits wurden mit der Real-Time Multiplex-PCR positive Ergebnisse bei 13 zuvor negativen Proben festgestellt, bei denen aufgrund des klinischen Verdachts sowie der positiven Resultate für andere Tiere dieser Bestände Chlamydieninfektionen zu vermuten waren.
Übereinstimmend positive Ergebnisse wurden ebenfalls bei der Untersuchung von 19 Coxiella-burnetii-positiven Templates festgestellt. Der Vergleich zu den Daten der in Oberschleißheim durchgeführten IS1111-PCR zeigte zwar eine strenge lineare Korrelation. Der durchschnittliche Ct-Wert der IS1111-PCR lag infolge des Multi-Copy-Targets allerdings um 6 niedriger.
Für die Überprüfung der Sensitivität des Nachweises von Neospora caninum standen neben eigenen Materialien auch Proben aus dem FLI Wusterhausen und dem LGL Erlangen zur Verfügung. Auch bei der Re-Analyse dieser Templates wurden die vorherigen positiven und 3 negative Ergebnisse bestätigt.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der simultane Nachweis von Chlamydiaceae, Coxiella burnetii und Neospora caninum mittels Real-Time Multiplex-PCR zur Diagnostik von Reproduktionsstörungen bei Wiederkäuern geeignet ist und sowohl die Zeit als auch die Kosten für den Nachweis dieser Erreger erheblich senken kann.
Danksagung
Herrn Dr. Ernst Großmann danken wir für die vertrauensvolle Überlassung der Sequenzen zur Real-Time PCR für den Nachweis von Neospora caninum.
Eine besondere Schwierigkeit bei der Methodenvalidierung stellt die Verfügbarkeit von definierten positiven Feldproben für die Prüfung der diagnostischen Sensitivität dar. Aus diesem Grund geht ein besonderer Dank an Dr. Juliana Drdlicek und Dr. Stephanie Christina Sörgel aus dem Team von Dr. Karl-Heinz Bogner (Erlangen), Dr. Gereon Schares (FLI Wusterhausen) sowie Dr. Pia Zimmermann (Oberschleißheim) für die Bereitstellung von entsprechenden DNA-Templates und der in ihren Labors ermittelten Ergebnisse.
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